Estudo comparativo entre as técnicas de aglutinação em látex
Estudo comparativo entre as técnicas de aglutinação em látex e de imunoglobulina para detecção de fator reumatoide.
Conforme descrito por Waaler em 1937, pacientes com artrite reumatoide (AR) apresentam anticorpos auto-reativos contra a fração Fc (fracionalizada) da imunoglobulina G (anti-IgC) no soro. Posteriormente, esses anticorpos foram denominados fator reumatoide (RF) (13) .
A detecção de RF no soro não está associada exclusivamente a casos de AR, mas também está relacionada a outras doenças auto-imunes, como lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, infecções bacterianas e até indivíduos saudáveis (3, 4).
Apesar da estreita associação entre o aumento da RF e o desencadeamento de doenças inflamatórias, a RF também pode desempenhar um importante papel fisiológico na regulação da resposta auto-imune como um todo:
- Depuração do complexo imune: os RFs dos isotipos de imunoglobulina G (IgC) e imunoglobulina M (IgM) se ligam a complexos imunes (complexos formados na conexão de antígenos e seus anticorpos específicos) para promover a sua opsonização, permitindo a remoção complexa por meio de Células fagocíticas;
- Processamento e apresentação do antígeno pelos linfócitos B (LB): a captura de RF por LB permite a internalização do antígeno para que ele possa processar essas moléculas e apresentá-las aos linfócitos T (LT) (5) ;
- Ativação do sistema do complemento por complexos imunes, tornando-os mais solúveis e, portanto, facilmente eliminados.
Outro aspecto importante que pode ser atribuído à formação natural de RF é o estabelecimento precoce do repertório de anticorpos. Alguns anticorpos podem se comportar de forma semelhante à RF.
No que diz respeito à fisiologia, a formação destes anticorpos pode estar ligada ou mesmo necessária para um estabelecimento precoce de repertório de anticorpos capaz de se ligar a uma ampla gama de ligandos (com baixa afinidade de ligação), permitindo assim mais uma “barreira” para Agentes de infecção, particularmente na mucosa (13).
Apesar do fato de que RFs são encontrados entre indivíduos saudáveis e em pacientes com doenças auto-imunes, principalmente a AR, os anticorpos são distintamente diferentes quanto à função. Os RF detectados em pacientes com AR possuem maturação de afinidade, enquanto que aqueles detectados em indivíduos saudáveis são multi-reativos, portanto, têm baixa afinidade.
Essas considerações levam-nos a destacar a hipótese de que os RFs naturalmente formados estão sob um rígido controle imunológico para evitar a aparência de anticorpos de alta afinidade, que possuem potencial altamente prejudicial (14) .
O teste de RF é freqüentemente aplicado para diferenciar a AR de outras formas de artrite crônica. Nos casos de AR, os títulos são geralmente mais elevados em comparação com outras patologias relacionadas.
No entanto, os resultados devem ser judiciosamente interpretados devido à especificidade limitada do método (80% de sensibilidade e 70% de especificidade em média) (21).
O aumento dos níveis de RF está diretamente relacionado com a presença de patologia e seu prognóstico, pois é corroborado nos casos de AR.Consequentemente, é possível notar lesões extra-articulares, bem como erosões radiológicas em pacientes com AR com aumento de RF (isotipo IgM acima de 50 UI / ml) (10) .
Do ponto de vista clínico, a detecção de soro de autoanticorpos desempenha um papel fundamental no diagnóstico e na classificação da doença.
Várias tecnologias foram aplicadas com o objetivo de identificar auto-anticorpos (imunofluorescência, ensaio de imunoabsorção enzimática [ELISA], imunoblot e teste de aglutinação) e todos eles demonstraram alta sensibilidade e especificidade.
Um número crescente de laboratórios importantes aplicou turbidimetria e / ou nefelometria para a detecção de RF, considerando principalmente a vantagem da automação e a liberação de resultados rápidos.
Os ensaios enzimáticos imunes são altamente recomendados quando é necessário diferenciar RF de acordo com a classe de anticorpos: IgG, imunoglobulina classe A (IgA) ou IgM. No entanto, eles não estão amplamente disponíveis em laboratórios de rotina (22).
Considerando o fato de que algumas tecnologias empregadas representam alguns obstáculos e limitações técnicas (algumas tendem a ser laboriosas, demoradas e semi-quantitativas), o desenvolvimento de técnicas que podem ser aplicadas de forma automatizada pode levar a uma redução nos custos operacionais, minimização de erros técnicos e diminuição do tempo de reação.
Assim, para obter ensaios de alto desempenho em tempo reduzido e com alta reprodutibilidade, é apropriado avaliar novas tecnologias que visem a quantificação de autoanticorpos, como RF (6) .
O presente estudo teve como objetivo comparar métodos de imunoturbidimetria e aglutinação (método de látex) para a determinação de RF no soro. Analisamos 304 amostras do Laboratório de Análise Clínica de Amparo-SP coletadas em 2007.
Os pacientes ambulatoriais de reumatologia do Hospital Municipal foram encaminhados para análise de RF. As amostras foram coletadas por punção venosa e distribuídas em tubos de 10 ml com pressão negativa e sem aditivo ou anticoagulante.
As amostras de soro foram obtidas após centrifugação de sangue venoso a 2.500 rotações por minuto (RPM) durante 10 minutos. As amostras lipêmicas e hemolisadas foram descartadas.
Detecção de RF pela técnica de aglutinação latex
Foi aplicado o kit directo Artritest (Wiener Lab Rosário-Argentina) para a detecção de RF (IgM) pelo método de aglutinação de látex.
O ensaio semi-quantitativo foi realizado de acordo com as recomendações técnicas do fabricante. De acordo com o fabricante, a concentração aproximada de RF na amostra pode ser calculada pela seguinte fórmula: RF (UI / ml) = reação de sensibilidade de x × 1 (1 UI / ml).
O estudo revelou 88% de sensibilidade e 96% de especificidade. Detecção de RF pelo método imunoturbidimétrico Foram utilizados sistemas Synchron CX 7-Delta Clinical System Beckman (Beckman Coulter ® Brea CA-EUA) e Línea Turbitest AA kit – (Wiener-Lab – Rosário – Argentina) para detecção de RF por imunoturbidimetria (autoanticorpos para RF-IgM / IgG ). As recomendações técnicas do fabricante foram seguidas.
Os valores considerados negativos variaram de 0 a 20 UI / ml.
Análise estatística
Inicialmente, todas as variáveis foram analisadas de forma descritiva.
A análise de variáveis quantitativas inclui valores mínimos e máximos, valores médios, desvio padrão e mídia. As frequências absoluta e relativa foram calculadas para as variáveis qualitativas.
A associação de aglutinação de látex e os métodos turbidimétricos foram realizadas por meio de teste não paramétrico de Mann-Whitney, na medida em que a normalidade dos dados coletados foi rejeitada.
A análise de correlação entre os métodos de aglutinação turbidimétrica e látex foi avaliada através do coeficiente de Spearman.
Caracterização da população estudada
Foram coletadas amostras de 304 pacientes com faixa etária de 8 a 88 anos (idade média de 48,06 ± 17,13 anos).229 (75,3%) eram do sexo feminino e 75 (24,7%) eram do sexo masculino.
Amostras lipídicas, ictéricas ou hemolisadas foram excluídas, determinando um total de 272 amostras analisadas.
Detecção de RF por método de aglutinação latex
Foram analisadas 272 amostras de um total de 304, dos quais 8,82% (24 amostras) foram considerados positivos (reagente de látex) após o teste semi-quantitativo.
Os títulos variaram de 2.048 (valor máximo) a 0 (valor mínimo), valor médio 14.74 e desvio padrão ± 132.5. 25% das amostras positivas eram do grupo masculino e 75% do grupo feminino.
Detecção de RF pelo método imunoturbidimétrico – Foram analisadas 272 amostras de um total de 304, dos quais 9,55% (26 amostras) foram positivas, considerando que 23,07% eram do grupo masculino e 76,93% eram do grupo feminino.
O título variou de 881 (valor máximo) a 2,5 (valor mínimo), valor médio 22,26 e desvio padrão ± 72. Vale ressaltar que todas as amostras consideradas positivas pelo método de aglutinação ao látex também foram confirmadas positivamente pela imunoturbidimetria ( Figura ).
Apenas duas amostras não foram consideradas positivas por ambos os métodos (positivos por imunoturbidimetria e negativas por aglutinação de látex), como é mostrado na Tabela .
O cálculo para a obtenção de valores de RF (UI / ml) foi realizado de acordo com as informações fornecidas pelo fabricante: RF (UI / ml) = título × sensibilidade à reação (1 UI / ml). R: reagente; NR: não reagente; RF: fator reumatóide.
Apesar de identificarmos duas amostras discordantes (positivas por imunoturbidimetria e negativas por aglutinação de látex), a determinação do coeficiente de Spearman permitiu a identificação de forte correlação positiva entre ambos os métodos (R 2 = 0,807)
Discussão
É amplamente conhecido que o RF não é produzido exclusivamente em condições patológicas e uma pequena porcentagem da população normal, principalmente idosos, pode ser positiva.
A prevalência de ambos entre indivíduos doentes e saudáveis varia de acordo com a sensibilidade e especificidade do método empregado (1) .Quanto aos estudos comparativos de métodos de detecção de RF e diagnóstico de AR, os dados da literatura ainda são muito limitados.
De acordo com o acordo para o diagnóstico e avaliação inicial da AR apresentada pela Sociedade Brasileira de Reumatologia 2011, a doença não deve ser diagnosticada através do desempenho de um único método de laboratório. Segundo os autores, a detecção de RF e a quantificação de anticorpos anti citrulina seriam considerados apenas marcadores prognósticos.
De forma isolada, o valor diagnóstico de RF é limitado, na medida em que 30% a 50% dos pacientes podem ser seronegativos para este autoanticorpo inicialmente. O RF também pode ser positivo para pacientes sem artrite, e sua positividade pode ser maior entre indivíduos idosos. Pode estar presente em várias outras condições reumatológicas ou não.
Assim, a negatividade para RF não exclui o diagnóstico de AR e sua positividade deve ser completamente interpretada de acordo com os achados clínicos. Os dados brasileiros (corte de incidência de AR inicial) mostram prevalência de RF em aproximadamente 50% dos pacientes.
De acordo com a investigação realizada por Mota et al., a detecção de IgM de isotipo pode ser considerada como um marcador útil para distinguir os pacientes com poli artrite que evoluiu para o estado clínico RA característico.
Aproximadamente 50% desses pacientes podem apresentar positividade à IgM da RA, enquanto que a detecção de outros isotipos ainda é altamente discutível. Independentemente do método aqui empregado para a detecção de RF, a maioria dos pacientes soropositivos eram do sexo feminino (76,93% de positividade por imunoturbidimetria e 75% por método de aglutinação de látex).
A causa ainda é desconhecida, mas há uma forte evidência de que os hormônios podem desempenhar um papel crucial no desenvolvimento da doença.
Um estudo caso-controle foi realizado na Suécia e os pesquisadores apontaram algumas características que podem aumentar ou diminuir o risco de AR em mulheres que foram positivas para os anticorpos RF e anti citrulina.
De acordo com esses autores, a influência hormonal é claramente demonstrada, na medida em que as mulheres que amamentaram por um período mais longo apresentaram maior risco para o desenvolvimento da doença, enquanto que as mulheres em uso de contraceptivos orais (> 7 anos) tiveram uma redução no risco de desenvolvimento RA.
Na nossa investigação, as pacientes do sexo feminino positivas para RF apresentaram média de 54,6 anos (39-77 anos), a maioria na menopausa (> 50%).
A análise de correlação entre ambas as técnicas demonstrou alta correlação positiva (R 2 = 0,8077). Portanto, em ambas as técnicas (tanto do mesmo fabricante) foi possível observar a positividade e aumentar nos níveis detectados quando as amostras foram positivas. Apenas dois eram discordantes (0,73%) num total de 272 amostras estudadas.
Da mesma forma, avaliando pacientes com AR e outras doenças reumatológicas e utilizando nefelometria e aglutinação de partículas de gelatina sensibilizadas, Spiritus et al. (18) demonstraram que este apresentou melhor desempenho diagnóstico em comparação com a nefelometria.
Conclusão
No entanto, os autores mostraram que a combinação de ambas as técnicas pode otimizar significativamente a detecção de RF em comparação com o uso isolado.
No que diz respeito à nossa investigação, é importante ressaltar que a alta correlação pode ser o resultado ou mesmo pode ser associada ao fato de que foram aplicadas diferentes técnicas, embora os kits comerciais fossem do mesmo fabricante.
Portanto, vale a pena mencionar que, se as mesmas técnicas forem usadas com kits comerciais de diferentes fabricantes (além do Laboratory Wiener), os resultados obtidos não devem ser extrapolados e é necessária uma nova validação.
Visser et al. (19) mostraram claramente que o teste ELISA pode ser considerado um teste de substituição razoável para o teste de aglutinação para a detecção de RF (IgM) em pacientes com AR, enfatizando o papel fundamental desempenhado pelos testes de aglutinação, bem como o desempenho diagnóstico (19) .
Saraux et al. (20) , depois de avaliar três métodos diferentes aglutinação de partículas de látex, ELISA-RF IgM e IgG anti-queratina) para o diagnóstico de AR, concluiu que todos eles apresentaram excelente discriminação no diagnóstico desta artropatia, o que evidencia o potencial de O teste de aglutinação para a dosagem de RF.
O estudo desses métodos distintos, embora com o mesmo objetivo em laboratórios de análise clínica, mostra vantagens e desvantagens para cada método, além de dados como sensibilidade, especificidade e custo-efetividade, que permitem a otimização de resultados obtidos.
Vale ressaltar que, para o desempenho da imunoturbidimetria, é necessária uma nova curva de calibração para cada alteração nos reagentes, enquanto que para o desempenho de métodos de reação de deslizamento com partículas de látex é necessário apenas um controle positivo ou negativo.
Quanto aos custos efetivos, os ensaios de aglutinação são mais acessíveis do que a turbidimetria. Por exemplo, um kit para aglutinação de slide é estimado em R $ 76,80 e realiza 50 testes.
Cada prova, portanto, é realizada ao custo de R $ 1,53. Considerando que a imunoturbidimetria (turba) é estimada em R $ 195,00 com desempenho total de 100 testes e o custo de cada teste é de R $ 1,95.
Consequentemente, em face dos resultados obtidos, podemos inferir que o método de aglutinação de látex para a detecção de RF é tão eficiente quanto a imunoturbidimetria.
Por outro lado, o último é rentável, não requer materiais excedentes e é rapidamente realizado. A escolha da imunoturbidimetria ou teste de aglutinação deve levar em consideração a demanda laboratorial (equipe técnica disponível, número de exames e público-alvo).
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