Validação da Técnica de Pirosequenciamento para a Classificação das Hemoglobinopatias
Os distúrbios relacionados à hemoglobina (Hb) são denominados hemoglobinopatias e podem ser classificados em dois grupos: Doenças Falciformes e Talassemias.
As Doenças Falciformes é um grupo de doenças hematológicas hereditárias causadas por variações estruturais no gene da cadeia α, β, ou γ da globina, surgem devido a polimorfismos de único nucleotídeo (SNP) ou mutações pontuais que caracterizam a presença da hemoglobina S (Hb S).
As Talassemias são causadas pela diminuição da síntese da cadeia α ou cadeia β da globina. As β Talassemias são divididas conforme o grau da mutação: ausência total da produção da cadeia β (β 0) ou produção parcial da cadeia β (β +).
Esta também pode ser classificada de acordo com a gravidade clínica: β Talassemia major, presença de duas mutações β 0 e β -Talassemia intermediária, resulta de duas mutações β + ou uma combinação β +β 0.
O diagnóstico das hemoglobinopatias é realizado por eletroforese de hemoglobina, mas muitas vezes é necessária a confirmação por testes moleculares.
A técnica mais utilizada é a PCR convencional seguida por digestão enzimática (RFLP). Está técnica é manual e difícil de ser implementada em larga escala.
Recentemente foi disponibilizada no mercado uma nova tecnologia de sequenciamento(pirosequenciamento) para detecção pontual de mutações a um custo semelhante à técnica de PCR, e com a capacidade de testar um grande número de amostras de forma semiautomatizada.
O objetivo deste estudo foi padronizar a técnica de pirosequenciamento para a classificação das hemoglobinopatias de amostras provenientes de quatro estados brasileiros: São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais e Pernambuco.
Foi realizado um estudo de corte transversal entre o período de março de 2015 a fevereiro de 2016, compreendendo a população de 400 pacientes com Hemoglobinopatias.
O ensaio foi desenhado
Ppara amplificar 9 pares de base do gene HBB, no qual utilizamos 10ng de DNA para amplificação da PCR.Para a classificação das hemoglobinopatias AS, Hb SS, Hb SC, foi utilizada a técnica de Pirosequenciamento usando o kit PyroMark Gold que é um método de sequenciamento enzimático, que funciona baseando-se na detecção do Pirosfosato (PPi ).
A técnica permite o sequenciamento rápido de sequencias de DNAs curtos, podendo ser utilizado pra análise de SNPs (Figura 1).
As análises foram realizadas no Software disponibilizado pelo fabricante, denominado Pyrograma (PQ24 Software) versão 2.1.
Conclusão
Genótipos Total Frequência (%)
SS 400/293 73
SC 400/81 20
AS 400/25 6
NS 400/01 1
(Não sequenciado)
A técnica de Pirosequenciamento para a detecção das mutações relacionadas ao gene HBB é uma ferramenta de alta confiabilidade para a classificação das Hemoglobinopatias e que se mostrou adequada para testagem em larga escala.
Referências
Patrinos GP, Kollia P, Papadakis MN. Molecular Diagnosis of Inherited Disorders: Lessons From Hemoglobinopathies. Human Mutation. 2005;26:399-412.
Traeger-Synodinos J, Harteveld CL, Old JM, Petrou M, Galanello R, Giordano P, et al.
EMQN Best Practice Guidelines for molecular and haematology methods for carrier identification and prenatal diagnosis of the haemoglobinopathies. European
Journal of Human Genetics. 2015;23:426-37
