Uso de uma técnica automatizada de pirosequenciamento para confirmação da Doença Anemia Falciforme.
O diagnóstico da doença falciforme (DF) é feito por ensaios de hemoglobina, como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), foco isoelétrico e eletroforese em acetato de celulose ou Agar Citrato. Esses ensaios são fáceis de executar e utilizados na triagem neonatal em larga escala em muitos países. No entanto, esses testes podem não diferenciar facilmente a talassemia Sβ0 da SS ou identificar outras variantes da hemoglobina e, nesse caso, pode ser necessário o sequenciamento do gene da hemoglobina (HBB).
Objetivos: Desenvolver um ensaio confirmatório baseado em DNA de alta produtividade para SCD e detectar mutações no gene HBB.
Métodos: Desenvolvemos uma técnica de pirosequenciamento automática (PyS) baseada na tecnologia QIAGEN (Hilden, Alemanha) para detectar mutações homozigotas ou heterozigotas da hemoglobina S, como bem como mutações na hemoglobina C. A técnica foi testada em 2.748 amostras de pacientes inscritos em uma coorte multicêntrica de DF no Brasil. Os pacientes foram previamente testados usando HPLC para diagnosticar SCD como parte dos cuidados clínicos de rotina. Quaisquer indivíduos com resultados discrepantes entre HPLC e PyS ou com hemoglobina S heterozigótica detectada tiveram sequenciamento de Sanger do gene HBB.
Resultados: Foram identificadas 168 amostras com resultados discrepantes entre HPLC e PyS e 100 com PyS concordante = S heterozigótico e HPLC, o que sugeriria talassemia SB ou outras variantes heterozigóticas de S. O ensaio PyS identificou corretamente 1906 (98,7%) das HbSS de 1930 e 628 (98,7%) das 636 amostras de HbSC. Das 179 amostras restantes, PyS indicou corretamente heterozigose S em 165 (92,2%). Das 165 amostras heterozigotas de S confirmadas por Sanger como consistentes com o genótipo de talassemia Sβ, 84 amostras foram classificadas como talassemia Sβ0 e 81 como talassemia Sβ +. As mutações beta-talassemia mais freqüentes de Sβ0 e Sβ + foram HBB: c.118C> T (Gln40Stop) e HBB c.92 + 6T> C, respectivamente. Discussão: O PyS provou ser satisfatório para testes confirmatórios em larga escala da mutação da hemoglobina. Além disso, com este estudo, fomos capazes de descrever as mutações β + e β0 mais comuns em pacientes com DF com talassemia-S em uma grande coorte multi-institucional de DF no Brasil.
Comentários: A ciência vem ampliando o menu de opções de técnicas para auxiliar nos diagnósticos das patologias que acometem a população. Esse artigo é uma evidência da necessidade de utilização de ensaios laboratoriais mais avançados para um diagnóstico preciso e consequentemente disponibilizar um tratamento eficaz para o paciente.
Professora Doutora: Cecília Alencar
*pirosequenciamento
Cursos Relacionados: https://www.ipessp.edu.br/site/cursos/hematologia-e-hemoterapia-laboratorial/
